在一些微生物实验室或者需要无菌操作的场所，想了解灭菌的具体效果就需要生物指示物的帮助。通常灭菌指的是用物理或化学的方式将目标微生物全部杀灭，使之达到无菌保障水平，一般最常用的有化学试剂、射线、湿热、干热以及过滤等除菌手段。针对不同的微生物采用的方法也不一样。而想要验证这些方法的效果，就需要一些具有灭菌耐受力的活微生物作为指示物来进行判断。
今天我们要讲的枯草芽孢杆菌黑色变种主要用于各类医疗机构及制药工业领域的消毒效果验证中，其原理是经过灭菌处置后含有枯草芽孢杆菌黑色变种的水样在通过孔径为0.45um的滤膜后，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36℃±1℃培养72h-96h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性。
检测所用试剂>1.酪氨酸琼脂培养基。
2.营养琼脂培养基。
3.淀粉培养基和碘液。
4.硝酸盐还原培养基和相关试剂。
5.甘油复红肉汤培养基。
6.甘露糖生化培养基。
7.甘露醇生化培养基。
8.苦杏仁苷生化培养基。
9.革兰氏染色液。
10.芽孢染色液。
11.阴性对照菌：如地衣芽孢杆菌。
12.阳性对照菌：枯草芽孢杆菌黑色变种。
13.枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液
按照《消毒技术规范》的规定制备，也可购买浓度范围在106CFU/ml-109CFU/ml之间的市售枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液。
14.无菌滤膜：直径50mm，孔径0.45μm的醋酸纤维滤膜。
按无菌操作要求包扎，经121℃高压蒸汽灭菌20min，晾干备用；或将滤膜放入烧杯中，加入实验用水，煮沸灭菌3次，15min/次，前2次煮沸后需换水洗涤2-3次。也可采用市售的无菌滤膜。
15.石蜡质封口膜。
16.无菌水：取适量实验级纯水，经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。
检测所需试剂>1.样品瓶：螺口带盖或磨口具塞的250ml、500ml广口玻璃瓶。
2.恒温培养箱：36℃±1℃。
3.高压蒸汽灭菌器：121℃，可调。
4.pH计：准确到0.1pH单位或更高精度。也可使用pH精密试纸。
5.显微镜：物镜4×或5×、10×、20×、40×，油镜100×，目镜10×或15×。
6.分析天平：实际分度值0.0001g。
7.培养皿：直径90mm。
8.过滤装置：配有砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗和真空泵，抽滤压力不低于-50kPa。
9.接种环：直径1mm-3mm。
10.镊子：不锈钢或一次性无菌塑料镊子。
11.刻度移液管：1ml、10ml。也可使用可调式移液器。
12.量筒：100ml。
13.锥形瓶：100ml。
14.酒精灯。
15.试管：10ml。
16.无菌操作设备：无菌室、超净工作台、生物安全柜。
17.一般实验室常用仪器和设备。
水样采集>评价使用高温高压灭菌设备的灭菌效果时，取样品瓶，加入枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液及200ml无菌水使混合液中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。灭菌处置完毕后，取出样品瓶，对水样进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。
评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液加入灭菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。灭菌处置完毕后，从灭菌设备中采集水样，进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。采样量一般为样品瓶容量的80%左右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎样品瓶。
样品采集后宜在2h内检测，否则应在10℃以下冷藏保存运输，但不得超过6h。实验室接收样品后，不能立即开展检测的，样品应在4℃以下冷藏保存，并在2h内检测。
水样过滤>用无菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置。将样品充分混匀后取100 ml 抽滤，以无菌水冲洗滤器内壁2-3 次。样品过滤完成后，再抽气约5s，关上开关。过滤前按照无菌操作要求调节样品的pH值至7.0-8.0。
培养流程>用灭菌镊子夹取滤膜移放在酪氨酸琼脂培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后用石蜡质封口膜封好培养皿，倒置培养皿，放入恒温培养箱内，36℃±1℃培养72h-96h。
培养96h后，如培养基上未有菌落生长，则试验终止；如培养基上有菌落生长，则挑取黑色的特征菌落于营养琼脂培养基上，36℃±1℃培养24h，待鉴定。同时将已挑菌落的酪氨酸琼脂培养基培养皿储存于2℃-5℃，以备必要时复查。
染色镜检>挑取黑色或可疑菌落，分别使用革兰氏染色液和芽孢染色液染色，枯草芽孢杆菌黑色变种革兰氏染色镜检以及芽孢染色镜检可以参考相关镜检图，枯草芽孢杆菌黑色变种为革兰氏阳性菌，营养细胞呈杆状，单个或呈短链状排列。
生化实验>挑取黑色或可疑菌落，分别接种到淀粉培养基、硝酸盐还原培养基、甘油复红肉汤培养基、甘露糖生化培养基、甘露醇生化培养基和苦杏仁苷生化培养基上。
空白对照实验>用无菌水按照过滤和培养步骤进行操作；培养96h后平板培养基上应无菌落生长，否则，该次样品鉴定结果无效，应查明原因后重新采样和检测。
阴性及阳性对照>将阴性对照菌和阳性对照菌制成浓度为40CFU/L-600CFU/L的菌悬液，分别按照过滤、培养、实验的步骤操作。阴性、阳性对照菌呈现的生化反应结果应与参照表所列结果一致，否则该次水样鉴定结果无效，此时查明原因后重新采样和检测。
结果判断>100ml水样中检出枯草芽孢杆菌黑色变种，即可断定灭菌不合格；而如果在100mL水样中未检出枯草芽孢杆菌黑色变种，可评价为灭菌合格。
境外医疗旅游，是坑还是商机？
编者的话：最近，国内舆论焦点对准医疗领域，很多人看好境外的医疗旅游市场。德国《世界报》称，全球医疗旅游行业价值约合4000亿欧元，未来十年内市场可能继续以每年25%的幅度增长。《环球时报》驻各国记者实地探访了热门国家的医疗旅游，发现尽管这一市场前景普遍被看好，但海外医疗能火多久仍是未知数，如要投资，需做好各方评估。
美国：中介催生医疗旅游热
本报驻美国特派记者 李晓宏
“美国每年接待约20万国际转诊患者，创造三四十亿美元的收入。以前欧洲来美就医者多，近3年中国客户增长迅速。”美国天机医学咨询中心执行总裁杨雷说，该中心就是瞄准这个趋势，3年前在纽约成立的。
杨雷介绍，中国患者赴美就医主要看两类疾病，一是癌症，二是不孕不育。前者多去美国东北部的麻省总医院、西北明尼苏达州的梅奥诊所、南部德州的MD安德森癌症中心，不孕不育患者青睐加州和纽约等地医院。
如今，美国在全球最先进的第三代试管婴儿技术及辅助生殖质控标准，每年吸引中国数万人赴美就医。在康涅狄格州新英格兰生育治疗诊所，北京一对高龄夫妇慕名美国第三代试管婴儿技术和基因检测技术，来做试管婴儿。当受精卵在暖房恒温仪器中培养了5天时，医生从处于囊胚期的胚胎滋养层中提取一两个细胞，进行基因疾病和染色体异常的筛查及人工干预，拿掉、修补缺陷基因后，将胚胎植入子宫。最终，让他们生育了一个健康宝宝。
“赴美医疗确实帮到一些患者。”美国先行国际医疗公司联合创始人朱晓伟说，美国一些先进的治疗方法和药品器械进入中国需要一段时间。有些中国患者肿瘤复发，在国内已无法医治，来美国接受癌症免疫治疗，病情得到稳定。也有肺癌晚期患者，到美国采用靶向疗法，延续生命。美国癌症5年生存率较高，总体达到66%，远高于中国31%的水平，一个重要原因在于康复期的治疗。因此，有些患者手术后，继续在美进行康复治疗。美国有专门的医疗签证，中介提供一站式服务。
“10年前，全球著名的德州MD安德森癌症中心一年有十几个中国患者，现在增加到几百个。”朱晓伟认为，这还与中介机构转诊网络铺得越来越大、宣传越来越多等有关。朱晓伟说，当前赴美医疗走的是高端路线，一些中介收费12万元人民币起价，增加接机、陪同患者第一次门诊等服务，增至15万元人民币。如果全程陪同，高达80万元人民币。而且美国的治疗费昂贵，至少是中国的两倍。
需求带来市场潜力。业内预测，随着中国中高收入人群不断增长，赴美医疗服务市场将保持高速增长。目前，该市场的中介有三类，一是中国在线医疗旅游平台，二是纽约天机医学咨询中心等美国当地服务公司，三是中美合资的美国诊所。
第一类的优势，在于十余年市场摸索积累的中国客源。第二类本土中介，人脉广，有条件获取美国优质医生医院资源。第三类结合了前两者的优势，如纽约GFG格莱宝美孕生殖中心。该中心的中方投资者慈铭体检集团，在为中国女性客户提供体检服务过程中，易发现有特殊生育需求患者。
面对商机，有人想投资朱晓伟，合作美国转诊生意，被他婉拒。“病人是一个国家的医疗资源，转诊国外不宜做得过大，有限转诊即可。”朱晓伟认为，“关键是把国外前沿技术、优秀医学人才转回国内”。
印度：医院参差不齐，风险不容小觑
本报记者 白云怡
联合国最近一份有关服务业的报告显示，印度正成为全球最受青睐的医疗旅游目的地之一，每年数以十万计的海外病人蜂拥来到印度。
中国商人在印度开办医疗旅游公司或经营医疗旅游业务前景如何？在印度海得拉巴制药中心工作多年的邹岚认为，这一行业非常“有发展”“有钱途”，因为患者可以在印度以相对低廉的价格接受更高质量的医疗服务。
“以丙肝这种疾病为例，在中国，一名患者要治愈丙肝需要花费4万元以上人民币，但在印度大概只需要8000元就可以。而仅丙肝患者中国就有超过1000万，这个市场有多大可以想象。”这名熟悉印度医药行业的专业人士对《环球时报》记者介绍说，“有时候患者甚至不需要前往印度，只要通过公司将资料发往印度医生那里即可进行远程治疗，所以成本很低”。
据印度工业联合会的一份报告称，印度的医疗服务收费水平一般是欧美国家的1/10。美国肝脏移植的价格在20万美元以上，但在印度只需1.4万美元；机器人膝盖手术这项尖端技术在中东和澳大利亚地区的费用高达8万美元，而在印度只需花费1万美元。
除了价格低廉，印度医院的医疗水平也相当不错。印度各大医院的医生，大部分从欧美国家的医学院取得博士学位后归国工作。
不过，邹岚提醒称，在经营医疗旅游时，从业者需要对医院和医生的选择极为谨慎，因为印度的各类医院水平参差不齐。“一般来说，印度的私立医院质量会更好。中国经营者切不可贪便宜而选择不靠谱的印度医院当做合作伙伴，不仅易引发医疗纠纷，更难进行国际诉讼”。
这一产业的风险也不可小觑。“最大的不确定因素在于医疗和政策带来的双重风险”，在印度工作生活多年的海外医疗服务公司“康安途”创始人杨晨对《环球时报》表示，目前对印度药物有强烈需求的中国患者主要是一些肿瘤和肝炎患者，他们经常带有一些天然的并发症，会为整个医疗过程带来更多复杂因素。从政策上来说，中国正在对医疗环境进行深入改革，与海外的差距势必越来越小，海外医疗的红利期还有多长并不确定。“由于医疗旅游是新兴行业，有关这类公司的资质要求、牌照颁发等相关规定都不健全，这些对投资者来说都是风险因素”。
在杨晨看来，印度医疗旅游行业天花板十分明显，因为国人需要的只是印度药品，况且这一行业内部竞争已很激烈。“相对赴印医疗旅游，在印经营医疗电商或许是更好的选择”。
泰国：泰式服务是主要卖点
本报驻泰国特派记者 张志文
国际会计师事务所普华永道今年发布的一份医疗旅游调查报告显示，根据2016年统计，泰国是全球接待医疗游客最多的目的地，人数达到229万人次。《环球时报》记者日前探访了泰国一家知名国际医院，了解泰国医疗旅游的优势所在及服务标准。
位于曼谷市区的康民国际医院，成立于1980年，是很多国家患者赴泰医疗旅游的选择之一。据介绍，去年这家医院共接待了来自190个国家的110万名患者。记者看到，这家医院内部装修高雅大方，就诊环境与普通医院很不一样，有种置身酒店的感觉。
康民国际医院国际事业发展部负责人塔尼·曼尼努对记者说，国际患者到达医院后，一般会有翻译陪同填写注册信息及就诊，“为了方便医患沟通，我们有超过30位各国医生负责患者与泰国医生之间的交流翻译”。同时，这家医院还在中国等国家设立联络处，国外患者可以通过联络处提前将病历等资料交由泰国医生会诊，随后反馈诊疗方案和费用。联络处还可以代办赴泰手续和酒店交通等服务，“可以一条龙地解决患者的需要”。
根据国际卫生保健研究中心的一项统计，泰国医疗游客数量正在以年均12%的速度增长。毕马威（泰国）医疗部门负责人塔纳特认为，多数泰国私立医院已经获得JCI国际联合委员会认证，并拥有高技术的医生团队，能够为中东和中南半岛国家患者提供高质量服务。塔尼也说，泰国私立医院拥有世界前沿医疗技术，悉心的泰式服务也是很多国际患者选择来这里就诊的主要原因之一。
北京华新康民健康管理有限公司董事长康丽娜对记者表示，辅助生殖、抗衰老治疗和健康体检是目前中国患者选择来泰就医的主要目的，相对国内优质医疗资源紧张的情况，在泰国可以较为方便地预约专家。
德国瑞士医疗高端，价格也美丽
本报驻德国特约记者 青木
说起医疗旅游，许多人会想到电影《茜茜公主》里的场景：这位巴伐利亚公主得了严重肺病后，放下一切，到处游山玩水，心情大好，病也奇迹般好了。这该是医疗旅游最著名的案例之一。如今，德国被称为全球最受欢迎的医疗旅游目的地之一。
德国经济研究所7月的一份报告表示，去年，到德国医疗旅游的外国人已经达到近30万，给德国带来18亿欧元收入。这些人大多来自欧洲、美国、俄罗斯、海湾国家和中国。
“德国医疗旅游主要有三种。”德国慕尼黑大学旅游经济学者普拉西尔对《环球时报》记者表示，一是健康旅游，《环球时报》记者曾参加过德国一家旅游机构的健康旅游，内容包括到阿尔卑斯山区，住在有机酒店，参加远足、健身等体育活动，还有健康膳食制定；二是疗养旅游，德国有300多个高级疗养温泉与疗养胜地，尤其适合病后康复者；三是住院旅游。这种主要集中在法兰克福、柏林、慕尼黑等大城市，那里有德国最著名的医疗机构，病人可以进行心脏手术、骨科手术等。
普拉西尔表示，外国人到德国医疗旅游并不难，还可以获得专门的医疗签证。但是费用是难点。尤其是第三种，如果是癌症等较严重的病症，治疗费用至少也得大几千欧元，甚至几万欧元。
最近几年，中国投资者也盯上了德国的医疗旅游商机。记者了解到，中国投资者的活动主要有两种：一是投资保健中心和健康酒店，主要客户是中国旅游者：二是购买德国面临倒闭的医院、疗养中心等。
相对德国，瑞士主要专注高端医疗旅游。《环球时报》记者前不久到羊胎素发源地及全球著名的抗衰老胜地——蒙特勒采访，蒙特勒有十多家私立医院。这里的医院除了注射羊胎素外，还提供面部拉皮、身材重塑或再造鼻子，以及乳腺癌术后或事故后的修复手术，也有心血管、关节炎等小手术，还有专门来全面体检的。
一位来自上海的正在当地接受医疗服务的游客告诉记者，医院特别提供“一整套服务”，包括机场接送，汉语翻译，精致的法国餐饮，一对一医师问诊，蒙特勒等地旅游等。但费用也很可观，一周全包疗程（不包来回飞机票），要价一万多瑞士法郎（1瑞士法郎约合6.8元人民币），时间长些甚至高达七八万瑞士法郎。蒙特勒旅游部门主管哈里对记者表示，每年在该地区私立医院接受治疗的病人总共入住2.5万人次以上。
瑞士《新苏黎世报》称，瑞士高端旅游近年来颇受外国人欢迎。每年约有4万外国游客来瑞士治疗，消费近13亿瑞郎。但不管是德国还是瑞士的医疗旅游，也常常被体验过的病人批评。一位患有严重关节炎的俄罗斯女病人，花了6000欧元到德国一家著名诊所做关节手术，并进行一周康复治疗，但手术并不成功。而瑞士的羊胎素、抗衰老等医疗旅游服务，引发的争议也很大。（2018-07-25）